Bref Résumé
Cette vidéo explique le fonctionnement de la cytométrie en flux, une technique puissante pour analyser les cellules. Elle aborde les principes de base, comment la lumière diffusée et la fluorescence sont détectées, et comment les données sont analysées. Les points clés incluent :
- Le système fluidique, les lasers, l'optique et les détecteurs sont les composants principaux d'un cytomètre de flux.
- La diffusion de la lumière (avant et latérale) fournit des informations sur la taille et la complexité interne des cellules.
- La fluorescence, souvent utilisée avec des anticorps marqués, permet d'identifier des molécules spécifiques sur ou dans les cellules.
- Les filtres sont essentiels pour collecter des données de fluorescence discrètes.
- Un seuil est utilisé pour exclure les petites particules et les débris de l'analyse.
Introduction à la Cytométrie en Flux
La cytométrie en flux est une technique d'analyse multiparamétrique de cellules individuelles au sein de populations hétérogènes. Elle est utilisée dans divers domaines, de l'immunophénotypage à l'analyse de l'expression de la GFP. Le cytomètre de flux analyse des milliers de cellules par seconde en les faisant passer à travers un faisceau laser et en capturant la lumière émise. Les données recueillies sont ensuite analysées statistiquement pour déterminer la taille, la complexité, le phénotype et l'état des cellules.
Composants Principaux d'un Cytomètre en Flux
Les principaux systèmes d'un cytomètre de flux comprennent le système fluidique, les lasers, l'optique, les détecteurs et le système informatique. Le système fluidique achemine les échantillons vers le point d'interrogation, où le laser et l'échantillon se croisent. L'optique collecte la lumière diffusée et la fluorescence résultantes. Les détecteurs reçoivent la lumière et le système informatique convertit les signaux en données numériques pour l'analyse.
Transport de l'Échantillon et Focalisation Hydrodynamique
Pour une collecte de données précise, les cellules doivent passer à travers le faisceau laser une à la fois. La plupart des cytomètres de flux réalisent cela en injectant le flux d'échantillon dans un flux de gaine de fluide ou de solution saline. Cela comprime le flux d'échantillon à environ une cellule de diamètre, un processus appelé focalisation hydrodynamique. Les cytomètres de flux peuvent généralement traiter des cellules dont la taille varie sur environ trois ordres de grandeur, la plupart des cellules détectées ayant un diamètre compris entre 1 et 15 microns.
Diffusion de la Lumière : Diffusion Avant (Forward Scatter)
Lorsqu'une cellule traverse le laser, elle réfracte ou diffuse la lumière dans toutes les directions. La diffusion avant (forward scatter), ou diffusion de la lumière à faible angle, est la quantité de lumière diffusée dans la direction avant lorsque le laser frappe la cellule. L'amplitude de la diffusion avant est approximativement proportionnelle à la taille de la cellule. Une barre d'obscuration est placée devant le détecteur de diffusion avant pour bloquer la lumière laser intense. La lumière diffusée autour de la barre d'obscuration est collectée par le détecteur et traduite en une impulsion de tension, dont l'amplitude est proportionnelle à la taille de la cellule.
Diffusion de la Lumière : Diffusion Latérale (Side Scatter)
La lumière diffusée à des angles plus importants, par exemple sur le côté, est causée par la granularité et la complexité structurelle à l'intérieur de la cellule. Cette lumière diffusée latéralement est focalisée à travers un système de lentilles et collectée par un détecteur séparé, généralement situé à 90 degrés du trajet du laser. Les signaux collectés par le détecteur de diffusion latérale peuvent être représentés sur des histogrammes unidimensionnels.
Graphiques de Dispersion Bidimensionnels (Scatter Plots)
Les histogrammes unidimensionnels ne montrent pas nécessairement la complexité des populations cellulaires. Les graphiques de dispersion bidimensionnels (scatter plots) permettent de visualiser les données dans une deuxième dimension. En utilisant les données de diffusion avant et latérale, on peut distinguer différentes populations de cellules sanguines périphériques, telles que les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes neutrophiles.
Détection de la Fluorescence
La fluorescence est l'émission de lumière par une fluorophore après excitation à un niveau d'énergie supérieur. En cytométrie en flux, des anticorps marqués avec des fluorophores sont souvent utilisés pour étudier les caractéristiques cellulaires. L'anticorps se lie à une molécule spécifique sur la surface ou à l'intérieur de la cellule. Lorsque la lumière laser de la bonne longueur d'onde frappe le fluorophore, un signal fluorescent est émis et détecté par le cytomètre de flux.
Collecte des Données de Fluorescence
La lumière fluorescente émise par les cellules suit le même chemin que le signal de diffusion latérale. Elle est dirigée à travers une série de filtres et de miroirs pour que des plages de longueurs d'onde particulières soient acheminées vers les détecteurs appropriés. La lumière fluorescente est traduite en une impulsion de tension proportionnelle à la quantité de fluorescence émise.
Expériences Bicolores et Spectres de Fluorescence
Pour les expériences bicolores, il est important de choisir des fluorophores compatibles, tels que l'Alexa Fluor 488 et la phycoérythrine (PE). Ces fluorophores peuvent être excités efficacement avec une lumière de 488 nanomètres, et leurs pics d'émission sont suffisamment éloignés pour permettre la collecte de données discrètes. Des filtres spécifiques, tels qu'un filtre passe-bande de 530 nanomètres pour l'Alexa Fluor 488 et un filtre passe-bande de 585 nanomètres pour la PE, sont utilisés pour capturer les pics de fluorescence de chaque molécule.
Nomenclature des Filtres
Les filtres sont définis par leur point central (pour les filtres passe-bande) ou leur point de coupure (pour les filtres passe-long ou passe-court). Par exemple, un filtre passe-bande typique pour la PE a un point central de 585 nm et une largeur de 42 nm, ce qui permet de faire passer de manière optimale la lumière dans la plage de longueurs d'onde de 564 à 606 nm, correspondant au pic d'émission de la PE.
Utilisation d'un Seuil (Threshold)
Un seuil est utilisé pour empêcher la collecte de données dominées par des informations provenant d'un grand nombre de petites particules, telles que les plaquettes et les débris. Un seuil est défini de sorte qu'une certaine taille d'impulsion de diffusion avant doit être dépassée pour que l'instrument collecte les données. Cela permet de s'assurer que la majorité des événements collectés par le cytomètre sont les cellules d'intérêt.
Conclusion
La cytométrie en flux est un outil unique qui permet aux scientifiques de recueillir des données statistiques sur un grand nombre de cellules et d'utiliser ces informations pour corréler plusieurs paramètres au sein d'une population cellulaire. Les expériences à quatre à six couleurs sont de plus en plus faciles, et certains laboratoires peuvent distinguer jusqu'à 18 couleurs simultanément. Le prochain tutoriel abordera les aspects plus complexes de l'analyse des données en cytométrie en flux.
